Wie überall im Straßenverkehr gilt auch auf Fahrradstraßen zunächst einmal das Gebot der gegenseitigen Rücksichtnahme.
Obwohl die Fahrradstraße ausdrücklich für den Radverkehr vorgesehen ist, sind aufgrund der gesetzlichen Regelung oder der örtlichen Ausschilderung gegebenenfalls andere Verkehrsarten zugelassen.
Radfahrer haben auf Fahrradstraßen grundsätzlich Vorrang. Sie dürfen hier auch nebeneinander fahren.
Kraftfahrzeug sind auf Fahrradstraßen nicht erlaubt, es sei denn, es gibt ein entsprechendes Zusatzzeichen.
Sind beispielsweise durch das Zusatzzeichen „Anlieger frei“ Kraftfahrzeuge zugelassen, dürfen Radfahrer nicht bedrängt werden. Kraftfahrzeuge müssen sich dem Tempo des Radverkehrs anpassen. Ist aufgrund der Fahrbahnbreite ein Überholen möglich, gilt auch hier der Mindestabstand von 1,5 m zum Radfahrer.
Die Höchstgeschwindigkeit von 30 km/h muss von allen Verkehrsteilnehmern eingehalten werden.
Wenn kein Gehweg vorhanden ist, können Fußgänger die Fahrradstraße nutzen. Um den Radverkehr nicht zu behindern, sollten sie am Fahrbahnrand gehen.
Krankenfahrstühle und Elektromobile für Menschen, die gehbehindert sind, dürfen die Fahrradstraße ebenfalls benutzen.